МЕТОДИ НА КУЛТИВИРАНЕ НА МИКРОРГАНИЗМИТЕ. ИЗСЛЕДВАНЕ НА КУЛТУРНИ И БИОХИМИЧНИ
ИМОТИ
Култивирането, тоест отглеждането на микроорганизми в лаборатория, се използва за изследване на техните свойства и за получаване на биомаса. Бактерии, гъби, актиномицети, спирохети и някои протозои се култивират върху хранителни среди. Хламидии, рикетсии, вируси и някои протозои могат да се възпроизвеждат само в тялото на животно или в живи клетки.
Културните свойства на този вид микроорганизми са: 1) необходимите условия за размножаване и 2) естеството на растежа върху хранителни среди. Културните свойства са една от характеристиките, които се вземат предвид при идентифициране (определяне на вида) на микроорганизмите.
Културни медии
Културните медии трябва да отговарят на определени изисквания. Те трябва да съдържат всички хранителни вещества, необходими за възпроизводството на този вид микроби. Някои патогенни микроорганизми растат върху обикновени хранителни среди, докато други се нуждаят от добавяне на кръв, кръвен серум и витамини за тяхното размножаване.
В хранителните среди трябва да се създадат определени условия чрез добавяне на натриев хлорид или буферни разтвори. За повечето бактерии е благоприятна хранителна среда, съдържаща 0,5% натриев хлорид. Реакцията на хранителната среда, благоприятна за повечето патогенни бактерии, е слабо алкална, което съответства на рН = 7,2-7,4. Vibrio cholerae расте при рН = 7,8-8,5, гъбите-при рН = 5-5,5. Културната среда трябва да бъде влажна, тоест да съдържа достатъчно количество вода, да е възможно най -прозрачна и стерилна, тоест преди сеитба да не съдържа микроби.
По отношение на състава и произхода хранителните среди са естествени, изкуствени и синтетични. Средствата за естествена култура са естествени продукти като картофи и други зеленчуци. Изкуствените хранителни среди се приготвят по специфична рецепта от продукти с добавяне на органични и неорганични съединения. Синтетичните среди съдържат определени химични съединения в известни концентрации.
По консистенция хранителните среди са течни, полутечни, плътни. Агар-агар-полизахарид, изолиран от водорасли, обикновено се използва като уплътнител. Агар-агарът не се използва от микроорганизми като хранително вещество; той образува гел във вода, който се топи при 100 ° C и се втвърдява при 45 ° C.
За да се получи гъста хранителна среда, се добавя агар-агар в концентрация 1,5-2%, за полутечност-0,5%.
Според предназначението им, хранителните среди могат да бъдат разделени на обикновени (прости), специални, избираеми, диференциална диагностика.
Конвенционалните (прости) хранителни среди се използват за култивиране на повечето микроорганизми, това е бульон от мезопатамия (MPB), мезопатамиен агар (MPA).
Специални хранителни среди се използват за отглеждане на микроорганизми, които не растат върху обикновени среди. Например кръвен агар и захарен бульон за стрептококи, серумен агар за менингокок и гонокок.
Избирателните културни среди се използват за изолиране на един вид от смес от различни бактерии. Този тип бактерии растат в тази среда по -бързо и по -добре от други, изпреварвайки ги в своя растеж; растежът на други бактерии се забавя на тази среда. Например, коагулиран серум за дифтериен бацил, алкална пептонова вода за холера вибрион, жлъчен бульон за тифен бацил, физиологичен разтвор за стафилокок.
Диференциални диагностични културни среди се използват за разграничаване на някои видове бактерии от други по тяхната ензимна активност (вж. Съответния раздел).
Култивиране и изолиране на чисти култури от аеробни бактерии
За отглеждането на микроорганизми са необходими определени условия: температура, аеробни или анаеробни условия.
Температурата трябва да е оптимална за вида. Повечето патогенни бактерии процъфтяват при 37 ° С. За някои видове обаче е оптимална по -ниска температура, което се свързва с особеностите на тяхната екология. Така че за чумния бацил, чието естествено местообитание са гризачите по време на хибернация, оптималната температура е 28 ° C, както при лептоспирите, за бацила на ботулизма - 28 ° C -35 ° C.
В допълнение към оптималната температура, за отглеждането на микроорганизми, в зависимост от вида, е необходима аеробна или анаеробна среда.
За да се изследва морфологията, културните, биохимичните и други свойства на микробите, е необходимо да се получи чиста култура. Обикновено култура от микроби се нарича тяхното натрупване върху хранителна среда под формата на мътност, растеж близо до дъното (стената) или филм на повърхността на течна среда или колонии върху плътна среда. От една микробна клетка се образува единична колония. Чистата култура е култура от микроби от същия вид, получена от една колония. В лаборатории някои известни щамове микроби се използват за различни изследвания. Щамът е чиста култура от микроби, получени от определен източник, в определено време, с известни свойства. Обикновено микробните щамове се обозначават с определен номер. Например, щамът Staphylococcus aureus 209P се използва за определяне на активността на пеницилин.
Изолирането на чисти култури от аероби обикновено отнема три дни и се извършва по следната схема:
1 -ви ден - микроскопия на намазка от тестовия материал, оцветена (обикновено по Грам) - за предварително запознаване с микрофлората, което може да бъде полезно при избора на хранителна среда за инокулиране. След това инокулиране на материала върху повърхността на замразения хранителен агар за получаване на изолирани колонии. Пресяването може да се извърши по метода на Дригалски в три чаши Петри с хранителна среда. Капка материал се нанася върху първата чаша и се разпределя по цялата чаша с шпатула. След това със същата шпатула разпределете останалата култура върху нея върху втората чаша и по същия начин върху третата. Най -голям брой колонии ще растат на първата плоча, най -малко на третата. Изолирани колонии ще растат на една от плочите, в зависимост от това колко микробни клетки са в тестовия материал.
Същият резултат може да се постигне чрез пресяване на една чаша. За да направите това, разделете чашата на четири сектора. Изследваният материал се инокулира с бактериологичен контур с удари по първия сектор, след което след калциниране и охлаждане на контура инокулацията се разпределя от първия сектор към втория и по същия начин последователно в третия и четвъртия сектор. Изолирани колонии се образуват от отделни микробни клетки след ежедневно инкубиране в термостат.
2 -ри ден - проучване на колониите, отглеждани на чинии, описание на тях. Колониите могат да бъдат прозрачни, полупрозрачни или непрозрачни, имат различни размери, заоблени правилни или неправилни очертания, изпъкнали или плоски, гладка или грапава повърхност, гладки или вълнообразни, назъбени ръбове. Те могат да бъдат безцветни или бели, златисти, червени, жълти. Въз основа на изучаването на тези характеристики, отглежданите колонии са разделени на групи. След това от изследваната група се избира изолирана колония, подготвя се намазка за микроскопско изследване, за да се провери хомогенността на микробите в колонията. Същата колония се инокулира в епруветка с наклонен хранителен агар.
3 -ти ден - проверка на чистотата на културата, отгледана върху наклона на агар чрез микроскопия с намазка. С хомогенността на изследваните бактерии, изолирането на чиста култура може да се счита за завършено.
За да се идентифицират изолираните бактерии, се изучават културни черти, тоест естеството на растежа върху течни и твърди хранителни среди. Например, стрептококи върху захарен бульон образуват дънна и париетална утайка, върху кръвен агар - малки, точни колонии; cholera vibrio образува филм върху повърхността на алкална пептонна вода и прозрачни колонии върху алкален агар; чумният бацил върху хранителния агар образува колонии под формата на "дантелени кърпички" с плътен център и тънки вълнообразни ръбове, а в течна хранителна среда - филм на повърхността, а след това - нишки, простиращи се от него под формата на " сталактити ".
Култивиране и изолиране на чисти култури от анаеробни бактерии
За отглеждането на анаероби е необходимо да се намали окислително-редукционният потенциал на средата, да се създаде анаеробиоза чрез отстраняване на кислорода чрез физични, химични или биологични методи.
Физическите методи включват:
1) механично отстраняване на въздуха с помощта на помпа от анаеростат, в който се поставят съдове с инокулации. В същото време можете да замените въздуха с безразличен газ: азот, водород, въглероден диоксид.
2) отглеждане в среда, съдържаща редуциращи вещества. Kitta-Tarozzi Wednesday е захарен бульон с парчета черен дроб или месо. Глюкозата и части от органи имат редуцираща способност. Средата се излива отгоре със слой вазелиново масло, за да блокира достъпа на кислород от въздуха.
3) Най -простият, но по -малко надежден метод е да расте дълбоко във висока колона захарен агар.
Химическите методи се състоят в това, че съдовете с реколти от анаероби се поставят в херметически затворен ексикатор, където се поставят химикали, например пирогалол и алкал, реакцията между които протича с абсорбцията на кислород.
Биологичният метод се основава на едновременното отглеждане на анаероби и аероби върху твърди хранителни среди в чаши Петри, херметически затворени след инокулация. Първо, кислородът се абсорбира от растящите аероби, а след това започва растежът на анаеробите.
Изолирането на чиста култура от анаероби започва с натрупване на анаеробни бактерии чрез инокулиране върху среда Kitta-Tarozzi. В бъдеще изолирани колонии се получават по един от двата начина:
1) материалът се инокулира чрез смесване с разтопен топъл захарен агар в стъклени епруветки. След като агарът се втвърди, в дълбочините му нарастват изолирани колонии, които се отстраняват чрез нарязване на тръбата и се субкултивират върху среда Кит-Тарози (метод на Weinberg);
2) инокулирането на материала се извършва върху плочи с хранителна среда и се инкубира в анаеростат. Изолирани колонии, отглеждани върху чиния, се субкултивират върху среда Kitt-Tarozzi (метод Zeissler).
Култивиране на други микроорганизми
Култивиране на микоплазми
Микоплазмите се култивират върху хранителни среди, допълнени със серум и въглехидрати. Тъй като на микоплазмите липсва клетъчна стена, те растат само в изотонична или хипертонична среда. На твърда хранителна среда в продължение на няколко дни се образуват много малки колонии, наподобяващи пържени яйца - с изпъкнал център и плоска полупрозрачна периферия. Микоплазмите могат да се отглеждат и в пилешки ембриони или клетъчна култура.
Отглеждане на рикетсии и хламидии
Рикетсиите и хламидиите са облигатни вътреклетъчни паразити. За тяхното отглеждане се използват клетъчни култури, пилешки ембриони и животински инфекции.
Отглеждане на гъби
За отглеждането на гъби се използват плътни и течни хранителни среди: най -често средата на Сабуро, както и среди, съдържащи бирена мъст. Гъбите растат по -бавно от бактериите, те образуват видим растеж в рамките на няколко дни. Температурата на отглеждане е по -ниска от тази на бактериите - 22-30 ° C.
Отглеждане на спирохети и протозои
Сред спирохетите е най -лесно да се отглежда лептоспира, за която водата, смесена със заешки кръвен серум, може да служи като хранителна среда.Борелиите и трепонемите се култивират при анаеробни условия върху по -сложни хранителни среди, съдържащи серум, парчета животинска тъкан.
Сред протозоите дизентерийната амеба, ламблията, трихомонадите, лейшманията, трипанозомата, балантидиите се култивират върху хранителни среди.Токсоплазмата се култивира в пилешки ембриони и тъканни култури. Методите за отглеждане на маларийни плазмодии са в процес на разработка.
Методи за изследване на ензимната активност (биохимични свойства)
В микробиологичната практика изследването на ензимната активност се използва за идентифициране на микроорганизми, тъй като всеки микробен вид има определен набор от ензими.
За да се определи протеолитичната активност, микробите се инокулират с инжекция в колона от желатин и след 3-5 дни инкубация при стайна температура се отбелязва характерът на втечняване на желатин: под формата на фуния, пирон, чорап или под формата на преобърната елха. Протеолитичната активност се определя и от образуването на продукти на разпадане на протеини: индол, сероводород, амоняк. За да ги определят, микроорганизмите се инокулират в бульон от месо-пептон, а индикаторните хартии се поставят между гърлото на епруветката и памучната запушалка, изключвайки контакта им със средата. Когато се образува индол, хартията, импрегнирана с наситен разтвор на оксалова киселина, става розова; в присъствието на сероводород хартията, импрегнирана с оловен ацетат, става черна; когато се образува амоняк, червената лакмусова хартия става синя.
За да се определят захаролитичните свойства на микробите, се използват диференциално -диагностични среди, като средата на Гис, средата на Олкеницки, средата на Ендо, средата на Левин, средата на Плоскирев.
Media Endo, Levin, Ploskirev в чаши на Петри се използват за диференциране на бактерии от чревната група по способността им да ферментират лактоза. Тези среди съдържат хранителен агар, лактоза и индикатор, който променя цвета си в кисела среда - индикатор за рН. Ако бактерии, които ферментират лактоза, например Е. coli, са засети в такава среда, в резултат на ферментацията на лактоза се образува киселина и индикаторът ще промени цвета си в кисела среда. Следователно колониите от ешерихия коли на такива среди ще бъдат оцветени според цвета на индикатора: върху средата на Ендо и Плоскирев - в червено, върху средата на Левин - в черно и синьо. Колонии от бактерии, които не ферментират лактоза, като салмонела и дизентерия, ще бъдат безцветни.
Гисовите среди (средно "разнообразни") се приготвят на базата на пептонова вода или полутечен месо-пептон агар. Съдържат всеки един въглехидратен или многоатомен алкохол и индикатор. Когато микробът расте върху средата на Гис, ферментирайки този субстрат с образуване на киселина и газ, средата ще промени цвета си, в полутечна среда ще се появят мехурчета и разкъсвания в дебелината на агара, в течна среда - газов мехур в стъклен поплавък. Когато субстратът ферментира само до киселина, има само промяна в цвета на средата.
Използват се и комбинирани среди, съдържащи не един въглехидрат, а два или три, например среда на Олкеницки. Една епруветка от тази среда замества наклонената агар и средата на Giss с лактоза, глюкоза и захароза. След стерилизация в разтопено състояние, средата в епруветката се скосява, така че да се получат колона и скосена част. Сеитбата се извършва чрез ход върху скосената част и убождане в колона. Когато ферментира лактоза или захароза, цветът на цялата среда се променя; когато ферментира само глюкозата, се променя само цветът на колоната. Образуването на газ се показва от наличието на мехурчета в агаровата колона. Когато микробите отделят амоняк, цветът на средата не се променя. Образуването на сероводород се проявява чрез почерняване в таблицата с агар
За експресен метод за определяне на ензимната активност на бактериите се използват микротестови системи и система от индикаторни хартии (NIB)
Системата за микротест е контейнер, направен от прозрачен полистирол, състоящ се от няколко клетки. Клетките съдържат изсушени хранителни среди с въглехидрати и показатели за рН. Във всяка клетка се инокулира суспензия от култура от бактерии с определена плътност. в контролните клетки
индикатор
Индикаторни хартиени системи (NIB) за идентифициране на семейството ентеробактерии са дискове или ленти от хроматографска хартия, покрити със защитен филм и съдържащи специфичен субстрат и индикатор. Чрез промяна на цвета на индикатора За да се определи сероводорода, дискът е поставени върху повърхността на MPA, засети с инжекция, което дава възможност едновременно да се определи подвижността
Във всички епруветки се вземат предвид предварителният резултат на същия ден и крайният резултат на следващия ден.
Оксидазната активност се определя чрез триене на културата върху индикаторна хартия.Резултатът се взема предвид след минута.
ИЗОЛИРАНИ ТКАНИ И РАСТЕННИ КЛЕТКИ
Култивиране на изолирани клетки и тъкани върху изкуствени хранителни среди при стерилни условия (инвитро) получи името на метода за култивиране на изолирани тъкани.
Поради факта, че семенните растения имат най -голямо значение в човешкия живот, методите и условията за тяхното отглеждане са разработени по -добре, отколкото за голосеменните или водораслите, чието отглеждане в стерилни условия създава определени трудности. Въпреки това, независимо от принадлежността на растенията към определена таксономична група, има общи изисквания за отглеждането на обекти в културата. инвитро.
Асептика. На първо място, отглеждането на фрагменти от тъкан или растителен орган - експланти, и още повече от отделни клетки, изисква пълна асептика. Микроорганизмите, които могат да влязат в хранителната среда, отделят токсини, които инхибират клетъчния растеж и водят до смъртта на културата. Следователно, за всички манипулации с клетки и тъкани по време на култивиранетоинвитро спазвайте определени правила за асептика в ламинарна кутия или в асептични помещения. В първия случай асептиката се постига чрез подаване на филтриран стерилен въздух, насочен от ламинарната кутия навън към работника. Асептичните помещения се стерилизират с помощта на ултравиолетови лампи и те работят в такива помещения в стерилно облекло. Работната повърхност на масите в асептични помещения и инструменти се стерилизира допълнително с алкохол преди работа.
Чистите съдове, предварително увити в хартия или фолио, инструменти, хартия, памучна вата се стерилизират чрез суха топлина във фурна при 160 ° C за 1,5-2 часа. Културните среди се стерилизират в автоклав при 120 ° C и високо налягане в рамките на 15 - 20 минути. Ако хранителните среди съдържат вещества, които се разлагат по време на автоклавиране, те трябва да бъдат стерилизирани чрез филтриране през бактериален филтър. След това стерилни филтрирани компоненти се добавят към автоклавираната среда, охладена до 40 ° С.
Самите растителни тъкани могат да служат като сериозен източник на инфекция, тъй като епифитната микрофлора винаги се намира на повърхността им. Следователно е необходима повърхностна стерилизация, която се извършва, както следва. Преди това частта от растението, от която ще бъде извлечен експлантатът, се измива със сапун и вода и се изплаква с чиста вода. След това растителният материал се стерилизира в разтвори на дезинфектанти. Някои от тези вещества, както и времето за стерилизация са представени в таблицата. 6.1.
|
Таблица 6.1 Стерилизация на оригиналния растителен материал (според R.G.Бутенко, 1999) Предмет |
Време за стерилизация, мин |
||
|
кисела киселина 0,1% |
живачен хлорид 0,1% |
водороден пероксид, 10-12% |
|
|
Семената са сухи |
15-20 |
10-15 |
12-15 |
|
Семената са подути |
6-10 |
6-8 |
6-8 |
|
Стъблена тъкан |
20-40 |
20-25 |
— |
|
Листа |
1-3 |
0,5-3 |
‘ 3-5 |
|
Върхове |
1-10 |
0,5-7 |
2-7 |
След като се държат експлантите в дезинфекционен разтвор, те се измиват няколко пъти в дестилирана вода и външният слой от клетки на филийките на експлантатите се отстранява със скалпел, тъй като може да се повреди по време на стерилизация.
Микроорганизмите могат да бъдат открити и в растителната тъкан. Вътрешната инфекция е най -често срещана при тропическите и субтропичните растения. Следователно, в допълнение към повърхностната стерилизация, понякога е необходимо да се използват антибиотици, които убиват микробната флора вътре в тъканта. Трябва обаче да се отбележи, че такова лечение не винаги води до стерилизация на вътрешните тъкани, тъй като е трудно да се избере целеви антибиотик.
Културни медии. Изолирани клетки и тъкани се култивират върху многокомпонентни хранителни среди. Те могат да се различават значително по своя състав, но съставът на всички среди задължително включва макро- и микроелементи, необходими за растенията, въглехидрати, витамини, фитохормони и техните синтетични аналози. Въглехидратите (обикновено захароза или глюкоза) са включени във всяка хранителна формула в концентрация от 2-3%. Те са необходими като хранителен компонент, тъй като повечето тъкани на калуса нямат хлорофил и не са способни на автотрофно хранене. Следователно те се отглеждат при условия на разсеяно осветление или на тъмно. Изключение е калусната тъкан на мандрагора, амарант и някои други растения.
Незаменимите компоненти на хранителната среда трябва да бъдат ^ ауксини, които причиняват дедиференциация на експлантираните клетки, и цитокинини, които индуцират клетъчното делене. Когато съотношението между тези фитохормони се промени или когато се добавят други фитохормони, могат да се причинят различни видове морфогенеза.
Високото съдържание на нитрати, амониеви, калиеви, фосфатни йони насърчава бързия растеж на клетките. Изчерпването на околната среда значително намалява растежа и процесите на вторичен метаболизъм. Въпреки това първоначално ниското съдържание на фосфати в хранителната среда може да стимулира синтеза на вторични метаболити. Установено е, че отглеждането на женско биле от женско биле върху среда с половин концентрация на азот и фосфор в тъмното увеличава съдържанието на фенолни съединения с 1,6 пъти в сравнение с калусите, отглеждани на пълна среда. Към средата могат да се добавят ендосперм на незрели ембриони (кокос, конски кестен и др.), Сок от някои дървета, различни екстракти (малц, мая, доматен сок). Въвеждането им в околната среда. do дава интересни резултати, но такива експерименти са трудни за възпроизвеждане, тъй като активната съставка обикновено не е известна точно. Например, добавянето на отделни фракции от кокосово мляко към хранителната среда не дава никакви резултати, докато нефракционираният ендосперм причинява клетъчното делене.
При приготвяне на твърди хранителни среди за повърхностно отглеждане на калусни тъкани се използва пречистен агар-агар, полизахарид, получен от водорасли. Като примери в табл. 6.2 показва композициите на най -разпространените културни среди.
Средата на Мурашиге и Скуг е най -разнообразната. Подходящ е за образуване на калуси, поддържане на неорганизиран растеж на калус и индуциране на морфогенеза при повечето двусемеделни растения. По този начин промяната в съотношението на ауксин и кинетин води до образуването на двата корена (преобладаване на ауксин), или; стволови култури (преобладаване на кинетин).
Средата Gamborg и Eveleg е подходяща за култивиране на клетки и тъкани от бобови и зърнени култури, средата на Уайт осигурява * вкореняване на леторастите и нормален растеж на стъблото след регенерация, а средата на Nitsch и Nitsch е подходяща за индуциране на андро-iгенезис в прашникова култура.
Физически фактори. За растежа и развитието на растителните тъкани; инвитро физическите фактори - светлина, имат голямо влияние; температура, аерация, влажност. |
Светлина. Повечето калусни тъкани могат да растат при слаба светлина или тъмни условия, тъй като не са способни да снимат *; синтезират.В същото време светлината може да действа като фактор, осигуряващ морфогенеза и активиращ процесите за втори път.
|
!Състав на хранителни среди, използвани при култивирането на клетки и тъкани (по R.G. Butenko, 1999) |
Концентрация на хранителни среди, mg / l |
|||
|
Медиен компонент |
Мурашиге и |
Гамборг и |
Бял, |
Нич и Нич, |
|
Скуг, 1962 г. |
Евелега, 1968 г. |
1939 |
1974-1975 |
|
|
KN03 |
1900 |
3000 |
81 |
950 |
|
NH4NO3 |
1650 |
— |
— |
720 |
|
Ca (N03)2 |
— |
— |
142 |
— |
|
Ca (N03)2-4Н20 |
— |
— |
— |
— |
|
(NH4)2S04 |
— |
134 |
— |
— |
|
MgS04-7Н20 |
370 |
500 |
74 |
185 |
|
CaCl2З20 |
— |
— |
166 |
|
|
CaClr2H20 |
440 |
150 |
— |
— |
|
KC1 |
— |
65 |
— |
|
|
KH2P04 |
170 |
— |
12 |
68 |
|
NaH2P04З20 |
— |
150 |
— |
— |
|
MnS04З20 |
— |
10 |
— |
— |
|
MnS0 „-4H20 |
22,3 |
— |
— |
25 |
|
ZnS04-4Н20 |
8,6 |
— |
— |
— |
|
ZnS04-7Н20 |
— |
2 |
— |
10 |
|
З3B04 |
6,2 |
3 |
— |
10 |
|
CuS04-5Н20 |
0,025 |
0,075 |
— |
0,025 |
|
Na2Mo04-2H20 |
0,25 |
0,25 |
— |
0,25 |
|
CoCl2-6Н20 |
0,025 |
— |
— |
— |
|
FeS04-7Н20 |
27,8 |
— |
— |
27,8 |
|
Na EDTA-2H20 |
37,3 |
— |
— |
37,3 |
|
Секвестрен 330-Fe |
28 |
— |
— |
|
|
Мезоинозит |
100 |
— |
— |
200 |
|
Аскорбинова киселина |
— |
— |
— |
3 |
|
Тиамин-HCl |
0,5 |
— |
— |
3 |
|
Пиридоксин-HCl |
0,5 |
— |
— |
1 |
|
Никотинова киселина |
0,5 |
— |
— |
— |
|
Захароза |
30 000 |
20000 |
2000 |
60 000 |
|
Агар "Difco", гел |
— |
— |
— |
7000 |
|
рит, агароза |
||||
синтез. Като източник на светлина се използват флуоресцентни лампи. За повечето тревисти растения оптималното осветление е около 1000 лукса. Твърде ниското (300 лукса) или високото (3000-10 000 лукса) осветление потиска растежа. Осветлението може да повлияе на метаболизма на калусните клетки. Така в културите на чаените растения биосинтезата на полифеноли се увеличава под въздействието на светлината. Напротив, в клетъчната култура Scopolia parvi-flora светлината потиска образуването на алкалоиди. В допълнение към интензитета на осветяване, качеството на светлината влияе върху тъканната култура и нейните физиологични характеристики. Така в клетъчните култури от магданоз се образуват повече от 20 флавони и флавонолни гликозиди след осветяването му с непрекъсната луминесцентна светлина „студено бяло“. В същото време синтезът на флавонови гликозиди се активира чрез последователно облъчване с ултравиолетова светлина, а след това от светлина, лежаща в областта на "червено-дълго вълново червено"
Температура. За повечето калусови култури оптималната температура е 26 ° C. В същото време калусите и клетъчните култури на Dioscorea deltoid растат добре дори при температура от 32 ° C. IN За разлика от растежа на клетъчни и тъканни култури, индуцирането на тяхната морфогенеза изисква по -ниски температури (18 - 20 ° C). Влияние на температурата върху клетъчния метаболизъм инвитро слабо проучени. Има доказателства, че в калусните култури максималното образуване на алкалоиди се наблюдава при температура 25 ° C и с повишаване на температурата рязко намалява. В суспензионни клетъчни култури Ипомея съдържанието на мастни киселини се е увеличило значително, ако са били отглеждани при неоптимални температури на растеж (15 ° C) Следователно, при отглеждане на култура инвитро необходимо е внимателно да се проучи влиянието на всички абиотични фактори, включително температурата, върху растежа и метаболизма на клетките.
Проветряване. За отглеждането на суспензионни култури аерирането е от голямо значение. Особено важно е да се снабдяват култивираните клетки с въздух в големи количества ферментатори.
При сравняване на различни видове ферментатори беше показано, че синтезът на вторични метаболити в суспензионна култура е най -голям, когато въздухът се подава отдолу. При отглеждане на клетки в малки обеми (в колби) се постига нормална аерация при постоянно разбъркване на суспензията.
Влажност. Оптималната влажност в помещението, където отглеждам! Културите трябва да са 60 - 70%.
По този начин отглеждането на клетки и тъкани зависи от много фактори на външната среда и тяхното действие не винаги е добро? стно. Ето защо при въвеждането на нов растителен вид в културата е необходимоT На първо място е необходимо внимателно да се проучи влиянието на физическите фактори върху растежа и физиологичните характеристики на тази култура.
Култивирането на изолирани клетки и тъкани върху изкуствени хранителни среди при стерилни условия (in vitro) се нарича метод на култивиране на изолирани тъкани.
Поради факта, че семенните растения имат най -голямо значение в човешкия живот, методите и условията за тяхното отглеждане са по -добре развити, отколкото при голосеменните или водораслите, чието отглеждане при стерилни условия създава определени трудности. Въпреки това, независимо от принадлежността на растенията към определена таксономична група, има общи изисквания за отглеждането на обекти в културата in vitro.
Асептика. На първо място, отглеждането на фрагменти от тъкан или орган на растение - експланти, и още повече за отделните клетки, изисква пълна асептика.Микроорганизмите, които могат да влязат в хранителната среда, отделят токсини, които инхибират клетъчния растеж и водят културата до смърт, поради което по време на всички манипулации с клетки и тъкани по време на in vitro култивиране се спазват определени асептични правила.
Културни медии. Изолирани клетки и тъкани се култивират върху многокомпонентни хранителни среди. Те могат да се различават значително по своя състав, но съставът на всички среди задължително включва макро- и микроелементи, необходими за растенията, въглехидрати, витамини, фитохормони и техните синтетични аналози. Въглехидратите (обикновено захароза или глюкоза) са включени във всяка хранителна смес в концентрация от 2-3%. Те са необходими като хранителен компонент, тъй като повечето тъкани на калуса нямат хлорофил и не са способни на автотрофно хранене. Следователно те се отглеждат при условия на разсеяно осветление или на тъмно. Задължителните компоненти на хранителните среди трябва да бъдат ауксини, които причиняват дедиференциация експлантни клетки и цитокинини, които индуцират клетъчното делене. Когато съотношението между тези фитохормони се промени или когато се добавят други фитохормони, се появяват различни видове морфогенеза.
Физически фактори. Растежът и развитието на растителните тъкани in vitro са силно повлияни от физическите фактори - светлина, температура, аерация, влажност. Повечето калусни тъкани могат да растат при условия на слаба светлина или тъмнина, тъй като не са в състояние да фотосинтезират. В същото време светлината може да действа като фактор, осигуряващ морфогенеза и активиращ процесите на вторичен синтез. За повечето калусови култури оптималната температура е 26 ° C. За отглеждането на суспензионни култури аерирането е от голямо значение. Особено важно е да се снабдяват култивираните клетки с въздух в големи количества ферментатори. Оптималната влажност в помещението, където растат култури, трябва да бъде 60-70%. По този начин отглеждането на клетки и тъкани зависи от много фактори на околната среда и техният ефект не винаги е добре известен. Следователно, при въвеждането на нов растителен вид в културата е необходимо преди всичко внимателно да се проучи влиянието на физическите фактори върху растежа и физиологичните характеристики на тази култура.
Дата на добавяне: 2016-06-02; показвания: 493;
ВИЖ ПОВЕЧЕ:
Процес на отглеждане клетки и тъкани върху изкуствени хранителни среди при стерилни условия (in vitro) се нарича метод за получаване на култура от изолирани тъкани. Изолираната тъканна култура обикновено е мазол и много по -рядко туморни тъкани (фиг. 3.1. и 3.2).
Култури от изолирани клетки и тъкани.
Използване на култура от изолирани клетки и тъкани.
Изолираните тъканни култури се използват широко в селското стопанство и промишленото производство. Те притежават предимства в сравнение с традиционните растителни материали (диви и отглеждани в плантации растения), а именно:
1. Независимост от външни условия.
2. Оптимизиране на условията на отглеждане.
3. Автоматизация и компютъризация на процесите.
4. Способността за отглеждане на застрашени растителни видове.
5. Възможност за масово клонално микроразмножаване на овощни и зеленчукови и декоративни растения.
6. Възстановяване от вирусни и други инфекции.
7. Възможност чрез култура инвитро, разширяване на областите на развъдна работа, тоест да се получи клонинги клетки, след това растения с програмирани свойства.
Поради способността на клетките да се синтезират в културата вторични метаболити, възниква нов клон на промишлеността, осъществяващ биологичния синтез на веществата, необходими на човека.
Условия за отглеждане на тъкани и клетки.
Култивиране на фрагменти от тъкан или едно растение - експланти, и още повече за отделните клетки, изисква пълна асептика.
Секретират микроорганизми, които могат да влязат в хранителната среда токсиниинхибира растежа на клетките и води културата до смърт. Следователно, всички манипулации с клетки и тъкани по време на култивирането инвитро се извършва при спазване на определени правила за асептика в ламинарна кутия или в асептични помещения. Асептиката се постига чрез подаване на стерилен въздух, преминаващ през филтрите, насочен от ламинарната кутия навън. На повърхността на растителните тъкани винаги има епифитна микрофлора. Следователно е необходима повърхностна стерилизация, която се постига чрез третиране на области от растения, от които те ще се изолират експланти, дезинфектанти (водороден пероксид, живачен хлорид).
За работа с биологичен материал са необходими следните компоненти:
- чисти съдове и биореактор (ферментатор);
- стерилна хранителна среда;
- оптимално осветление;
- оптимална температура;
- оптимална влажност;
- аерация.
Чисти съдове и ферментатор. Инструментите и памучната вата, предварително опаковани в хартия или фолио, се стерилизират чрез суха топлина сушилен шкаф при температура 160 ° C за 1,5-2 часа.
При използване на различни видове ферментатори е установено, че физиологичните свойства на културите могат да се променят; следователно синтезът на вторични метаболити в суспензионна култура трябва да се извършва с подаване на въздух отдолу. При тези условия синтезът протича много по -активно (фиг. 3.3).
При отглеждане на клетки в малки обеми, например в колби, се постига нормална аерация при постоянно разбъркване на суспензията.
Културни медии... Култивирането на изолирани клетки и тъкани се извършва в многокомпонентни хранителни среди... Те могат да се различават значително по своя състав, но съставът на всички среди задължително включва компонент фондацията, към които се добавят групите вещества, необходими за растенията: макро- и микроелементи, въглехидрати, витамини и фитохормони. Такава компонентна основа е агар -агар - полизахарид от водорасли, способен да образува гелове във вода, които се втвърдяват при 45 ° С. Може да се добави към хранителната среда ендосперм незрели ембриони (кокос, конски кестен), сироп някои дървета, различни екстракти (малц, мая), доматен сок. Въвеждането им в околната среда дава положителен резултат. Всеки активен компонент обаче има технологични характеристики, присъщи само на него.
Ориз. 3.3. Биореактор (ферментатор) за отглеждане на микроорганизми, клетки или тъкани
Дедиференцирането е в основата на процеса на образуване на калус.
Дедиференцирането е връщане на специализирани клетки в меристематично състояние, когато те придобият способността да се делят.
Органите и тъканите на растенията служат като изходен материал за получаване на култури от клетки и тъкани, но за това по -често се използват листата на растенията.
Обработеният преди това стерилен фрагмент от листа се поставя върху твърда хранителна среда. Листата се състоят от различни тъкани, клетките на които са диференцирани и синтезират различни молекули протеини, въглехидрати, липиди и други вещества, характерни за тези клетки. Тези диференцирани клетки нямат способността да се делят.
В процеса на механично увреждане на листа експлантатът се освобождава и под влияние на растителни хормони, добавени към околната среда, ауксини и цитокинини клетката е дедиференцирана. Той губи съхраняващи вещества - нишесте, протеини, липиди, специализирани органели, хлоропласти и пр. В резултат на това всички клетки придобиват нови близки морфологични и физиологични свойства, т.е. стават калусни (делящи се) клетки. На експлантацията на листа се образува калусна тъкан.
Видове клетъчни култури. В зависимост от метода и условията на отглеждане, има няколко типа клетъчни и тъканни култури:
- култура на калус;
- суспензионна култура;
- единична клетъчна култура.
Ако култивиране случва се повърхностно на хранителна среда агар, след това се образува калусна тъкан. Той няма ясна структура, но може да варира по плътност. Произходът и условията на отглеждане определят дали калусната тъкан е хлабава, със средна плътност или плътна.
Обща характеристика на калусните клетки. Калусната клетка има редица общи свойства с всички растителни клетки... Това е онтогенезата на клетките, устойчивостта към определени неблагоприятни фактори на околната среда и други свойства. В същото време, по време на култивирането си, калусните клетки придобиват свои индивидуални характеристики, като физиологична асинхронност, генетична хетерогенност и някои други.
Физиологична асинхронност се крие във факта, че във всеки момент от време клетките са в различни фази на растеж: някои се делят, други растат, а трети вече остаряват. Следователно общото физиологично стареене на цялата популация от калусни клетки обикновено се оценява от състоянието на повечето клетки (фиг. 3.4).
Ориз. 3.4. Калус клетки вОриз. 3.5. Протопластът излиза през
Добавена дата: 2016-05-28; показвания: 1915;
Подобни статии:
